Marcadores genéticos são quaisquer informações que possam caracterizar e diferenciar um indivíduo e, que sejam reproduzidas em seus descendentes.
A definição de marcadores moleculares já revela a importância de seu desenvolvimento. Entender características herdadas, assim como predizer comportamentos pode ser vantajoso, em diferentes campos e áreas de conhecimento. Os marcadores são fundamentais em programas de melhoramento genético de plantas e animas. Também tem importante função no diagnóstico de doenças em humanos e animais. Além serem fundamentais em rastreio de cadeias produtivas de alimentos e de garantia de qualidade de produção.
A seguir, conheça os principais tipos de marcadores moleculares, suas especificações e aplicações.
Introdução aos marcadores
Até meados dos anos 60, a classe de marcador mais utilizada era a dos marcadores morfológicos. Isso era devido ao fato de serem fáceis de avaliar. No entanto, esse tipo de marcador apresenta algumas desvantagens:
-Na maioria das vezes, os marcadores morfológicos só explicam características qualitativas. Estas podem ser, por exemplo, cor de flor, formato de semente e hábito de crescimento.
-O número de marcadores morfológicos é pequeno.
– Os marcadores morfológicos sofrem influência ambiental.
Por tudo, esses marcadores não são suficientemente seguros em determinadas situações. Então, fez-se necessário um estudo de marcadores mais completos, a nível de DNA de forma a caracterizar um fenótipo por meio de genes expressos ou segmentos específicos de DNA.
Os marcadores moleculares
Os marcadores moleculares, em contraste aos marcadores morfológicos, apresentam três características importantes:
- Eles são caracterizados pela variação nos nucleotídeos da sequência de DNA.
- São herdados geneticamente e,
- Não são influenciados pelo ambiente.
São descritos hoje, vários tipos de marcadores moleculares. O que vai determinar a escolha de um ou outro marcador será o estudo das diferenças de seus princípios, a aplicação para a qual se destina e os recursos técnicos e financeiros da instituição.
Com o desenvolvimento de diferentes classes de marcadores, eles podem ser divididos em grupos. Veja, a seguir.
Marcadores moleculares baseados no rendimento
Os marcadores moleculares baseados no rendimento são definidos de acordo com a quantidade de loci genotipados por vez. Podem ser:
- low trhoughtput genotyping (Genotipagem de baixo rendimento): Permite genotipar poucos loci por vez.
- high throughput genotyping (Genotipagem de alto rendimento): Genotipam milhares de loci simultaneamente.
Esses marcadores diferenciam-se pela capacidade em discriminar alelos. Esta é uma característica bastante importante, de acordo com o estudo a ser realizado.
Marcadores moleculares baseados no modo de ação gênica
- Marcadores moleculares dominantes: possibilitam a identificação da presença ou ausência de um determinado alelo.
- Marcadores moleculares Codominantes: possibilitam diferenciar indivíduos homozigotos e heterozigotos, diferentemente dos marcadores dominantes.
Marcadores moleculares baseados no Método de detecção
A principal categoria de classificação dos marcadores moleculares é baseada no método de detecção que pode ser de três diferentes maneiras:
- Hibridação
- PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Sequenciamento
A seguir, iremos detalhar um pouco mais sobre os marcadores quando baseados no método de detecção.
Marcadores moleculares Baseados em hibridação
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms):
Primeiro marcador molecular a ser desenvolvido.
Após a obtenção do DNA, ele é clivado com enzimas de restrição conhecidas. Após clivagem é gerado um grande número de fragmentos com diferentes tamanhos. Com a eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, os fragmentos são separados, gerando diferentes bandas. Cada banda corresponde a um determinado fragmento com diferente tamanho. Isso ocorre devido às substituições de base única (deleções, mutações, inversões, translocações e transposições)na sequência de reconhecimento da enzima de restrição alterarem o padrão dos fragmentos de restrição resultantes.
Os primeiros mapas genéticos baseados em DNA e o primeiro estudo de associação bem-sucedido foram baseados em marcadores de RFLP (Kerem, B. et al, 1989). Além disso, análises por RFLP de DNA mitocondrial (mtDNA) e ribossômico (rDNA) têm sido utilizadas para genética de populações, levantamentos biogeográficos e filogenéticos.
Vantagens: Expressão codominante, resultados estáveis e reprodutíveis, cobertura ampla do genoma, possibilidade de utilização de sondas heterólogas.
Limitações: Desenvolvimento de sondas é oneroso e laborioso, não permite automatização de suas etapas e não existe uma biblioteca de sondas para espécies de menor importância econômica.
Aplicações: Estudos de variabilidade genética, estrutura de populações, identificação de espécies.
Baseados em Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA):
A amplificação do DNA genômico é alcançada por PCR usando o iniciador único, curto (10 nucleotídeos) e aleatório.
Durante a PCR, a amplificação ocorre quando dois locais de hibridação são semelhantes entre si e na direção oposta. Com isso, são amplificados fragmentos aleatórios no genoma, sem necessidade de um conhecimento prévio da sequência de DNA. Para a visualização, a PCR é então separada em gel de agarose corado com brometo de etídio. O polimorfismo presente nos locais de ligação ao primer ou entre eles pode ser detectado na eletroforese, confirmando a presença ou ausência de bandas específicas. É um marcador dominante, não permite verificar homo e heterozigotos.
O polimorfismo revelado pelo RAPD podem ser mutações, inserções ou deleções no sítio de pareamento do primer.
Vantagens: Facilidade de execução, não exige sequenciamento e desenho de primer específicos, necessita de pouca quantidade de DNA, amostram regiões de DNA repetitivos.
Desvantagens: Baixa informação genética em cada loco e baixa reprodutibilidade.
Aplicação: Determinação da diversidade e estrutura genética, estabelecimento de relações filogenéticas e diferenciação de espécies próximas.
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)
No AFLP, duas enzimas de restrição (uma de corte raro e uma de corte frequente) são usadas para clivagem do DNA. Cada um dos fragmentos resultantes é ligado a adaptadores com sequências conhecidas. Em seguida é feita amplificação seletiva dos fragmentos.
Nesta etapa os fragmentos são submetidos a PCR com dois primers diferentes. Um consiste na sequência do adaptador da enzima de corte raro acrescido de um ou mais nucleotídeos aleatórios na extremidade 3’ e o outro na sequência do adaptador de corte frequente seguida de nucleotídeos arbitrários.
Os produtos da amplificação são separados em gel de poliacrilamida desnaturante. O polimorfismo é observado pela presença ou ausência das bandas.
Vantagens: Analisar simultaneamente várias regiões do genoma e alta reprodutibilidade. Devido ao alto valor informativo, esses marcadores permitem acessar diferenças genéticas entre indivíduos, populações e espécies.
Desvantagens: Dificuldade de identificar variantes alélicos em loco específico, sendo assim utilizado como marcador dominante.
Aplicações: Estudos filogenéticos, discriminação de variedade, diagnósticos de doenças, análise de pedigree, construção de mapas de ligação e clonagem de genes de interesse.
ISSR (Inter Sequence Simple Repeats)
Baseia-se na amplificação de segmentos de DNA localizados entre duas regiões idênticas de microssatélites repetidos, mas orientadas de maneira oposta, a uma distância que permite a amplificação. Os produtos amplificados têm 200–2000 pb de comprimento e podem ser visualizados através de agarose ou PAGE.
Vantagens: simples, fáceis de entender em comparação com o RAPD e não há necessidade de conhecimento prévio das sequências de DNA. Podem ser usados no desenvolvimento de marcadores codominantes.
Desvantagens: são caracterizadas como marcadores dominantes.
Aplicações: estimar a diversidade genética entre indivíduos e análise fingerprinting.
Microssatélites (SSR – Simple Sequence Repeat)
Os microssatélites ou SSR são motivos curtos de um a seis nucleotídeos repetidos em tandem e estão abundantemente presentes no genoma. No entanto, também são encontrados em cloroplastos e mitocôndrias.
Os SSRs representam a menor repetição por locus com maior nível de polimorfismo. Esse alto nível de polimorfismo é devido à ocorrência de vários números de repetições nas regiões microssatélites e pode ser detectado com facilidade por PCR.
A ocorrência de SSRs pode ser devida ao slippage do DNA de fita simples, recombinação do DNA de fita dupla, transferência de elementos móveis (retrotransposons) e incompatibilidades. Principalmente as sequências que flanqueiam os SSRs são conservadas e são usadas no desenvolvimento de primers.
Vantagens: São codominantes, com alta reprodutibilidade e maior abundância no genoma.
Desvantagens: Desenvolvimento de marcadores espécie-específicos.
Aplicações: Esses marcadores apresentam diversas aplicações no melhoramento de plantas, como caracterização da estrutura e diversidade genética, seleção assistida por marcadores (SAM), mapeamento e estudos genéticos.
Baseados em sequenciamento
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
Baseiam-se na detecção polimorfismo resultantes da alteração de uma única base no genoma. Geralmente possuem natureza bi-alélica e são abundantes no genoma, tanto em regiões expressas quanto não-expressas.
Diferentes estratégias são utilizadas para identificação de SNPs. Atualmente, o sequenciamento em larga escala do genoma de vários táxons tem permitido a identificação de SNPs por meio da exploração de milhares de sequências geradas.
Independentemente do método de identificação de SNPs é fundamental o uso de ferramentas de bioinformática para auxiliar nesse processo. E deve-se realizar a validação experimental desses polimorfismos. Podendo ser por microarranjos, DHPLC, espectroscopia de massa, PCR em tempo real, sequenciamento de única base, entre outros.
Vários métodos recentes de genotipagem de alto rendimento, como NGS, GBS e PCR alelo-específico tornam os SNPs os marcadores mais atraentes para a genotipagem.
Vantagens: Permitem genotipar milhares de loci simultaneamente e possuem natureza codominante.
Desvantagem: não são multialélicos, e, portanto, limitados para estudos de diversidade genética a nível de população e alto custo de desenvolvimento.
Aplicações: São fundamentais na análise de genes e nas descobertas de base genética moleculares, seleção assistida por marcadores, GWAS, identificação de plantas haploides/diploides, genotipagem de cultivares, auxílio em etapas de retrocruzamento para um gene de interesse, mapeamento genético e de QTLs.
DArT (Diversity array technology)
É uma técnica que oferece grande oportunidade para a genotipagem de loci polimórficos, que são distribuídos pelo genoma. É uma tecnologia de hibridação de microarranjos altamente reproduzível.
Não há necessidade de uma sequência de informações para a detecção de loci para uma característica de interesse. Para descobrir marcadores polimórficos por essa tecnologia, um ensaio de reação única pode genotipar milhares de loci genômicos. Para pontuação e descoberta de marcadores, uma plataforma idêntica é utilizada. Após a descoberta de um marcador, não há necessidade de ensaios específicos para genotipagem, exceto o início da montagem dos marcadores polimórficos em uma matriz de um único genótipo.
Vantagens: Alto rendimento, altamente polimórfico, não são necessárias informações da sequência anterior, alta reprodutibilidade.
Desvantagens: Marcador dominante e alto custo de desenvolvimento.
Aplicações: Esses marcadores polimórficos nas matrizes de genotipagem são comumente usados para genotipagem.
Fontes
Borém, A.; Caixeta, E. T. Marcadores moleculares. Viçosa-MG: UFV, 2006. 532p.
Nadeem et al. (2017) DNA molecular markers in plant breeding: current status and recent advancements in genomic selection and genome editing. Biotechnology e Biotechnological Equipment. v. 32, n. 2, p. 261-285.
Toppa, E. V. B.; Jadoski, C. J. O Uso dos Marcadores moleculares no melhoramento genético de plantas. Scientia Agraria Paranaensis, v. 12, n. 1, p. 1–5, 2013.
Sociedade Brasileira de Genética https://www.sbg.org.br/sites/default/files/e_book_marcadores_moleculares_sbg_2017_final.pdf
