Você um dia já se perguntou como são realizadas as análises nas amostras que nos envia? São análises de detecção de transgênicos, identificação de espécies animais, vegetais ou precursores de alergênicos? Todas elas se encaixam na proposta deste artigo que é apresentar para você o caminho de suas amostras em nosso laboratório: do ponto de partida ao ponto de entrega. Acompanhe.
Eis que um dia você percebe que conhecer a matéria-prima que utiliza em sua produção, ou mesmo as características de seus produtos, é de suma importância. Ou percebe, que você precisa daquele suporte rotineiro em análises. Decide então enviar suas amostras ao laboratório que mais entende mercado nacional e de fazer análises moleculares de interesse do agronegócio: a LaborGene. Afinal, somente quem tem mais de 20 anos de história, pode oferecer um serviço de extrema qualidade, segurança e eficiência.
Mas suponhamos que mesmo tendo a tranquilidade de saber que suas amostras estão com a melhor equipe, no melhor laboratório, você tenha a curiosidade ou mesmo a necessidade de conhecer um pouco mais de nossos processos. É pensando nisso que agora iremos apresentar todo o caminho percorrido por suas amostras no nosso laboratório, quais os pontos de destaque em cada processo e todo o nosso cuidado até a elaboração dos laudos de análises.
Índice de conteúdo:
– Do ponto de partida ao ponto de chegada
– Do recebimento ao envio de resultados (Não se engane. Identidade é única!!!)
– Preparo de amostras (Amostra Liberada! Vamos para o início dos testes)
– A Reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR)
Do ponto de partida ao ponto de entrega
É importante, nesse momento, que você saiba que nossos processos seguem os requisitos da norma ISO 17025. Essa é uma norma internacional para reconhecimento de competência de laboratórios de ensaio e calibração.
Seguir os requisitos dessa norma significa que prezamos pela qualidade de nossos processos e pela segurança de nossos resultados antes de qualquer coisa. Todos os nossos protocolos foram pensados para excelência no resultado. Todas as nossas equipes são altamente capacitadas e treinadas para a execução dos procedimentos, sem desvios.
Outra coisa que é importante que você saiba é que nossas atividades são executadas em diversas salas do laboratório, seguindo um fluxo unidirecional. As salas possuem equipamentos (incluindo EPIs) e utensílios próprios de forma que não há deslocamentos de materiais de uma sala para a outra (com exceção da amostra em análise e de soluções que são preparadas em sala específica para abastecimento de todo o laboratório). Essa manobra é importante para mantermos o controle de contaminações cruzadas.
Do recebimento ao envio de resultados (Não se engane. Identidade é única!!!)
Aqui suas amostras são tratadas com todo cuidado para que jamais percam sua identidade. A isso damos o nome de controle de contaminações cruzadas, dentro de um extenso processo de controle de qualidade. Dessa forma iremos conhecer suas matrizes com segurança e alta sensibilidade.
Nosso procedimento de Recebimento de Amostra é aplicado dada a chegada de sua amostra em nossas instalações. Sabe aquela FEA – Ficha de encaminhamento de amostra, que pedimos que você preencha e encaminhe junto de sua amostra? É onde você seleciona o tipo de análise que irá realizar. Suponhamos então que seja para a detecção de transgênicos. Então, ela é utilizada, inicialmente, neste ponto. Com base no que está descrito nela, fazemos a conferência de todos os itens de auditoria, conforme está descrito em sua Proposta Comercial.
A partir daí, avaliamos a possibilidade de contaminação de uma amostra com outra amostra presentes em uma mesma embalagem, verificamos as condições de temperatura de recebimento, rótulo da amostra e descrições na FEA e demais parâmetros. Sua amostra agora tem novo nome, um código interno que seguirá com sua amostra até a emissão do laudo. É através desse código que conseguimos rastrear prontamente as informações referentes ao serviço que você contratou.
Estando tudo certo com o que foi acordado e descrito, sua amostra está apta para seguir para a análise. Mas se algo estiver em desacordo, não se preocupe! Você será acionado antes mesmo de iniciarmos qualquer procedimento, e sua amostra seguirá bloqueada até que resolvamos todas as pendências.
Preparo de amostras (Amostra Liberada! Vamos para o início dos testes)
Temos diversos protocolos de extração de DNA de materiais. O que determina a diferença entre eles é exatamente o tipo de material recebido. Nesta etapa iremos determinar o protocolo a ser seguido e o preparo mais indicado para a sua amostra.
Na Sala de Preparo de Amostras iremos dividir a sua amostra em: sub amostra, amostra contra prova e excedente. Embora não temos muitos registros de análises de contra-prova na LaborGene, caso haja a necessidade, dentro de um tempo determinado em contrato, você poderá solicitar uma análise contra prova.
As sub amostras seguem para a Sala de Extração de DNA, enquanto as amostras contra prova permanecem em custódia nesta sala de preparo.
A extração de DNA
Agora vamos para a parte que determina a sua análise. A etapa de extração de DNA.
Temos diferentes métodos de extração de DNA, para as diversas matrizes que estamos aptos a receber. A escolha do método a ser empregado varia de acordo com a sua constituição da amostra. Por exemplo, se a sua amostra for rica em proteínas, teremos procedimentos apropriados para que o DNA dessa amostra seja isolado das proteínas e, para isto, um protocolo é preferido.
Fique tranquilo: essa seleção é baseada em referências técnicas. Mas, caso um protocolo de extração não recupere o DNA presente em sua amostra, iremos realizar um novo procedimento de extração, preferencialmente diferente do primeiro, antes de entendermos que a sua amostra não contem DNA íntegro para a análise. Isso pode acontecer em casos de amostras altamente processadas, além de outras situações específicas.
Durante a execução dos protocolos desta fase utilizamos um Controle de Extração. A finalidade deste controle é verificar as possíveis contaminações em alguma etapa da extração, bem como a contaminação dos reagentes. Então, um tubo semelhante a aquele contendo a sub amostra, recebe todos os reagentes e é submetido a todos os processos pelos quais passam a amostra. No entanto, este tubo é vazio.
Este controle é adicionado em todas as placas para amplificação por PCR (Reação em Cadeia da DNA Polimerase) as quais a amostra irá passar. Durante a análise do resultado é possível verificar se houve contaminação e em qual etapa do processo.
Extraído o DNA da sua amostra, este será submetido à quantificação em espectrofotômetro para verificação de qualidade e padronização da quantidade de DNA a ser encaminhado para a análise.
O preparo do MIX
Então, o DNA de sua amostra, foi extraído e está em qualidade e quantidade suficientes para a análise de Detecção de Transgênicos.
Para as análises de Detecção de Organismos Geneticamente Modificados (OGM) em grãos e alimentos, realizadas pelo nosso Laboratório, utilizamos a metodologia da Reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR).
Esta técnica é altamente sensível, sendo que o limite de detecção que empregamos é de 0,1%. Dessa forma, em todas as nossas análises, um controle positivo contendo este valor de transgenia estará presente, além de outro controle positivo com valor percentual de transgenia maior. Com tão alto nível de sensibilidade, pequenas interferências podem ser detectadas.
Na sala de Preparo de Mix, iremos montar o que chamamos de Mix Reacional, que é a preparação de todos os insumos de reação de PCR, em quantidade adequada, para a análise do alvo em questão. Iremos nesta fase dosar, de acordo com as descrições constantes em nossos procedimentos operacionais padrão, as quantidades de materiais a serem utilizados.
Dentre os reagentes de mix, estão os primers, ou iniciadores, elementos que tornam a reação de PCR específica para o alvo em análise. Nós utilizamos primers validados internacionalmente e adquiridos de fornecedores qualificados por nossos processos internos. No caso da sua análise de detecção de transgênicos, temos primers selecionados de acordo com os alvos específicos que você deseja avaliar.
O preparo do Mix Reacional acontece em uma área específica, onde não há a presença de nenhum tipo de DNA. Esse cuidado é redobrado, para que seja evitada a contaminação de nossos materiais com DNA extraído, favorecendo a ocorrência de resultados falsos. Para evidenciar que o mix não foi contaminado, nesta etapa contabilizamos o Branco Reacional, que será adicionado à placa de PCR sem nenhuma amostra. Caso haja a amplificação do Branco Reacional, ou do Controle de Extração, toda a análise deverá ser reconduzida, de acordo com os nossos padronizados critérios de resultados de análise.
O preparo das placas
De maneira simplificada, o nosso objetivo é multiplicar várias vezes um determinado alvo, caso ele esteja presente em sua amostra. Ao multiplicá-lo exponencialmente, seremos capazes de visualizar a presença deste alvo anteriormente oculto, por uma metodologia denominada eletroforese.
Veja: Temos o DNA de seu material extraído, que é onde estará presente o alvo que iremos buscar. Temos também, o Mix Reacional preparado, que é o conjunto de insumos necessários para que a multiplicação do alvo (caso presente) ocorra. Só nos falta agora unir estes dois componentes e oferecer as condições de temperatura para que essa multiplicação, ou amplificação, aconteça.
Nas placas de amplificação é que unimos o DNA extraído com os materiais necessários para a multiplicação do alvo em estudo.
Recapitulando: Além das amostras, colocamos na placa: controles positivos (sendo um deles o limite de detecção do método), um controle negativo (branco) da reação, que apresenta todos os reagentes utilizados na reação de PCR, exceto DNA; além do controle de extração. Este procedimento garante o controle de contaminação durante a execução da reação de PCR bem como o controle de contaminação dos reagentes que são adicionados na mesma.
A Reação em Cadeia da DNA Polimerase
(PCR)
Montada a placa reacional contendo as amostras, controles positivos e negativos, falta agora inseri-la em condições de temperatura que permitam que a reação de amplificação aconteça.
O conjunto é então inserido em um equipamento denominado termociclador. Este tem por função submeter o conjunto a variações de temperatura por tempos programados para a otimização das reações de amplificação. Ao terminar a programação estabelecida, a sua amostra terá amplificado o alvo em estudo, caso ele esteja presente.
Utilizaremos em sua análise um de nossos equipamentos que está presente em nossa sala de PCR e pós PCR. Mas e se você quiser saber o código do equipamento que foi utilizado na sua análise? Fácil. Temos essa o e outras várias informações em nossos formulários de análise, de controle interno. Por meio dele que sabemos qual reagente foi utilizado na sua análise, qual pipeta e até mesmo o nome do arquivo digital onde salvamos as imagens do resultado de sua análise. Isso faz parte de nosso controle de qualidade e permite que qualquer desvio seja prontamente detectado.
O resultado
Finalizada a amplificação, vamos à fase de verificação dos resultados. Esta etapa também acontece na sala de PCR e pós PCR, através da técnica de eletroforese.
Sua amostra e demais controles, após a finalização da amplificação, são depositadas, separadamente, em pequenos poços presentes em um gel permeável ao DNA. Um marcador de tamanho de molécula de DNA é também colocado em um dos poços do gel.
Este gel é imerso em uma cuba contendo uma solução que permite a passagem de corrente elétrica. E a passagem da corrente elétrica favorece a migração das moléculas presentes nas amostras, ao longo do gel, até a extremidade final. As moléculas menores deslocam-se com maior facilidade, havendo-se assim, uma separação por tamanho. Dessa forma, o alvo multiplicado de DNA irá deslocar-se ao longo do gel assim como ocorrerá com as amostras de controle positivo e de marcador de tamanho de DNA.
Está presente no gel, ou fora aplicado juntamente com as amostras, uma substância denominada intercalante de DNA. Este intercalante, emite uma fluorescência visível em luz UV, que é como o resultado do teste é verificado. Assim, caso o alvo tenha sido multiplicado, ele será visualizado na presença de luz UV.
Após o tempo necessário para a conclusão da eletroforese, o gel é colocado em equipamento específico para a emissão da luz UV e captura da imagem formada. E o resultado da análise de sua amostra será analisado criteriosamente por nossa equipe técnica.
Considerações
Como você está realizando uma análise de detecção OGMs, provavelmente você escolheu iniciar suas análises por um screening geral. Se este é o caso, sua amostra pode passar por até três ciclos como este: um para a avaliação do alvo 35S, um para a avaliação do alvo NOS e, caso os resultados sejam negativos, uma análise de um alvo constituinte (análise de endógeno), obrigatoriamente presente na amostra, para que seja eliminada a possibilidade de um falso negativo.
Caso as reações tenham comportamento esperado, ou seja, resultado definido, controles positivos amplificados e negativos não amplificados, sua análise será entregue antes do que imagina. Mas se algum de nossos controles falhou, iremos repetir sua análise até que nossos critérios de qualidade sejam atingidos. Mas não se preocupe! Os resultados sempre são entregues dentro do prazo acordado.
Nos certificados de análises, colocamos todas as informações oferecidas na Ficha de encaminhamento de amostra. Também, colocamos o código que sua amostra recebeu de nossa equipe, informações sobre a metodologia e outros pontos importantes. Mas nosso trabalho com você não termina na entrega do resultado. Caso haja dúvidas, nossa equipe estará sempre à disposição.
Então. Gostou de nosso tour? Venha garantir a sua tranquilidade conosco.
LaborGene AgroGenética – Qualidade, Segurança e Eficiência
Nós podemos ajudar você.
Na LaborGene realizamos análises de detecção de transgênicos em diferentes matrizes. As análises podem ser de três formas:
Qualitativa ou Screening geral. Tem como objetivo a detecção dos alvos 35S e NOS que são alvos presentes na maior parte das construções genéticas de transgênicos. Veja em: Screening geral(http://laborgene.com.br/servico/deteccao-de-ogms-screening-geral-35s-e-nos/).
Quantificação de OGMs. Visa determinar qual o teor de contaminação transgênica no produto, em relação ao constituinte (milho ou soja). Veja em: Quantificação de OGMs
IEE ou Identificação de evento específico: Análise que visa determinar qual o evento transgênico que está presente no produto em análise. Veja em: IEE
Realizamos também:
IEV ou Identificação de espécie vegetal: Análise que visa determinar a presença de material de origem vegetal, em diferentes matrizes. Amplamente utilizada para a detecção de alvos precursores de alergias (trigo e soja). Veja em: IEV.
IEA ou Identificação de espécie animal: Análise que detecta alvos comuns em espécies animais. Amplamente aplicada na comprovação da autenticidade de alimentos, quanto a presença de espécies animais e de alvos que são precursores de alergênicos: bovinos, caprinos, bufalinos (leites) e galináceo (ovos). Veja em: IEA.
Conheça mais sobre nossos serviços em www.laborgene.com.br.
Fonte: Equipe LaborGene AgroGenética
